MINISTARSTVO POLJOPRIVREDE, RIBARSTVA I RURALNOG RAZVOJA

2844

Na temelju članka 10. stavka 4., članka 11. stavka 5., članka 14. stavka 4. i članka 50. Zakona o biljnom zdravstvu (»Narodne novine«, br. 75/05), ministar poljoprivrede, ribarstva i ruralnog razvoja donosi

PRAVILNIK

O IZMJENAMA I DOPUNAMA PRAVILNIKA O PROVOĐENJU SUSTAVNOG ISTRAŽIVANJA I MJERA ZA SPRJEČAVANJE ŠIRENJA I SUZBIJANJE PRSTENASTE TRULEŽI GOMOLJA KRUMPIRA KOJU PROUZROKUJE BAKTERIJA CLAVIBACTER MICHIGANENSIS (SMITH) DAVIS ET AL. SSP. SEPEDONICUS (SPIECKERMANN ET KOTHOFF) DAVIS ET AL.

Članak 1.

U Pravilniku o provođenju sustavnog istraživanja i mjera za sprječavanje širenja i suzbijanje prstenaste truleži gomolja krumpira koju prouzrokuje bakterija Clavibacter michiganensis (Smith) Davis et al. ssp. sepedonicus (Spieckermann et Kothoff) Davis et al. (»Narodne novine« br. 119/06) u članku 1. briše se točka i dodaju se riječi: »i shema testiranja za dijagnosticiranje, detekciju i identifikaciju bakterije Clavibacter michiganensis (Smith) Davis et al. ssp. sepedonicus (Spieckermann et Kothoff) Davis et al..«

Članak 2.

Članak 3. stavak 5. mijenja se i glasi:
»(5) Laboratorijsko testiranje iz stavka 3. i 4. ovoga članka provodi se sukladno postupku iz Priloga II »SHEMA TESTIRANJA ZA DIJAGNOSTICIRANJE, DETEKCIJU I IDENTIFIKACIJU BAKTERIJE Clavibacter michiganensis (Smith) Davis et al. ssp. sepedonicus (Spieckermann et Kothoff) Davis et al.« koji je tiskan uz ovaj Pravilnik i njegov je sastavni dio (u daljnjem tekstu: propisani postupak).«

Članak 3.

Prilog tiskan uz Pravilnik o provođenju sustavnog istraživanja i mjera za sprječavanje širenja i suzbijanje prstenaste truleži gomolja krumpira koju prouzrokuje bakterija Clavibacter michiganensis (Smith) Davis et al. ssp. sepedonicus (Spieckermann et Kothoff) Davis et al., postaje Prilog I.

Članak 4.

Ovaj Pravilnik stupa na snagu osmog dana od dana objave u »Narodnim novinama«.
Klasa: 011-02/08-01/18
Urbroj: 525-2-08-1
Zagreb, 16. srpnja 2008.

Ministar poljoprivrede,
ribarstva i ruralnog razvoja
mr. sc. Božidar Pankretić, v. r.

PRILOG II.

SHEMA TESTIRANJA ZA DIJAGNOSTICIRANJE, DETEKCIJU I IDENTIFIKACIJU UZROČNIKA PRSTENASTE TRULEŽI, BAKTERIJE

Clavibacter michiganensis (Smith) Davis et al. ssp. sepedonicus (Spieckermann et Kotthoff) Davis et al.

PODRUČJE PRIMJENE SHEME TESTIRANJA

Prikazana shema testiranja opisuje različite postupke za:
(i) dijagnosticiranje prstenaste truleži u gomoljima i biljkama krumpira;
(ii) detekciju bakterije Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus u uzorcima gomolja i biljaka krumpira;
(iii) identifikaciju bakterije Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus (C. m. subsp. sepedonicus).

OPĆA NAČELA

Optimizirani protokoli za pojedine metode, validirani reagensi i pojedinosti za pripremu materijala za testiranje i kontrolnih materijala navedeni su u Dodacima. Popis laboratorija koji su sudjelovali u optimizaciji i validaciji protokola nalazi se u Dodatku 1.
S obzirom da protokoli uključuju detekciju karantenskog organizma i uključivat će uporabu vijabilnih kultura C. m. subsp. sepedonicus kao kontrolnih materijala, postupci će se morati izvoditi u primjerenim karantenskim uvjetima s odgovarajućom opremom za zbrinjavanje otpada te prema uvjetima dozvola koje izdaju nadležna tijela za biljnu karantenu.
Parametri testiranja moraju osigurati dosljednu i ponovljivu detekciju onih razina C. m. subsp. sepedonicus prema propisanim pragovima detekcije za pojedine metode.
Precizna priprema pozitivnih kontrola je nužna.
Testiranje u skladu s potrebnim pragovima detekcije podrazumijeva pravilno postavljanje, održavanje i kalibriranje opreme, pažljivo pohranjivanje i rukovanje reagensima te poduzimanje mjera za sprječavanje kontaminacije među uzorcima, npr. razdvajanje pozitivnih kontrola od uzoraka za testiranje. Moraju se primijeniti standardi kontrole kvalitete kako bi se izbjegle administrativne i druge pogreške, posebice pri označavanju uzoraka i vođenju dokumentacije.
Sumnja na zarazu, kao što je navedeno u članku 4. stavku 1. Pravilnika o provođenju sustavnog istraživanja i mjera za sprječavanje širenja i suzbijanje prstenaste truleži gomolja krumpira koju prouzrokuje bakterija Clavibacter michiganensis (Smith) Davis et al. ssp. sepedonicus (Spieckermann et Kothoff) Davis et al. (u daljnjem tekstu: Pravilnik), podrazumijeva pozitivan rezultat testa za dijagnosticiranje ili testa provjere provedenog na uzorku kao što je prikazano u dijagramima toka.
Ako je rezultat prvog testa provjere (IF ili PCR/FISH) pozitivan, tada se sumnja na zarazu bakterijom C. m. subsp. sepedonicus i mora se provesti drugi test provjere. Ako je rezultat drugog testa provjere pozitivan, tada je sumnja potvrđena i testiranje se mora nastaviti prema shemi testiranja. Ako je rezultat drugog testa provjere negativan, tada se smatra da uzorak nije zaražen bakterijom C. m. subsp. sepedonicus.
Dakle, pozitivan rezultat IF testa, kao što je navedeno u članku 4. stavku 3. definiramo kao pozitivno očitanje IF testa koje je potvrđeno drugim testom provjere (PCR/FISH).
Potvrđena zaraza, kao što je navedeno u članku 5. stavku 2. Pravilnika, podrazumijeva izolaciju i identifikaciju čiste kulture C. m. subsp. sepedonicus te potvrdu patogenosti.

1. PRIKAZ DIJAGRAMA TOKA

1.1. Shema za detekciju i dijagnosticiranje uzročnika prstenaste truleži u gomoljima i biljkama krumpira sa simptomima prstenaste truleži
Postupak testiranja je namijenjen za gomolje i biljke krumpira sa simptomima tipičnim za ili koji pobuđuju sumnju na prstenastu trulež. Postupak uključuje brzi test provjere, izolaciju patogena iz zaraženog provodnog tkiva na dijagnostičkoj hranjivoj podlozi i, u slučaju pozitivnog rezultata, identifikaciju čiste kulture kao bakterije C. m. subsp. sepedonicus.

(1) Opis simptoma naveden je u Dijelu 2.
(2) Prikladni testovi su:
– IF test (Dio 4),
– PCR test (Dio 6),
– FISH test (Dio 5).
(3) Iako je izolacija patogena iz biljnog materijala s tipičnim simptomima metodom razrjeđivanja i nasađivanja na hranjivu podlogu jednostavna, uzgoj može biti neuspješan iz uzoraka u naprednom stadiju infekcije. Saprofitske bakterije koje rastu na oboljelom tkivu mogu prerasti ili inhibirati patogen na hranjivoj podlozi. Stoga se preporuča korištenje neselektivne i selektivne hranjive podloge, najbolje MTNA (Odjeljak 8) ili biotest (Odjeljak 7).
(4) Opis tipične morfologije kolonije naveden je u Dijelu 8.
(5) Ako je rezultat izolacije negativan, ali simptomi bolesti su tipični, tada je potrebno ponoviti postupak izolacije.
(6) Pouzdana identifikacija čiste kulture C. m. subsp. sepedonicus postiže se provođenjem testova navedenih u Dijelu 9.
(7) Test patogenosti opisan je u Dijelu 10.
1.2. Shema detekcije i identifikacije bakterije Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus u uzorcima gomolja krumpira bez simptoma
Načelo
Postupak testiratestiraijenjen je za detekciju skrivene zaraze u gomoljima krumpira. Pozitivan rezultat iz najmanje dva testa provjere, koji se temelje na različitim biološkim načelima, mora se dopuniti izolacijom patogena, nakon kojeg slijedi, u slučaju izolacije tipičnih kolonija, potvrda čiste kulture kao C. m. subsp. sepedonicus. Pozitivan rezultat samo jednog od testova provjere nije dovoljan da bi se uzorak smatrao vjerojatno zaraženim.
Testovi provjere i izolacija moraju omogućiti prag detekcije 103 do 104 stanica/ml resuspendiranog taloga, uključenog kao pozitivna kontrola u svakoj seriji testova.

(1) Standardna veličina uzoraka je 200 gomolja, iako se postupak može provesti i na manjim uzorcima ako nije na raspolaganju 200 gomolja.
(2) Metode ekstrakcije i koncentracije patogena opisane su u Dijelu 3.1.
(3) Ako su rezultati najmanje dva testa, koji se temelje na različitim biološkim načelima, pozitivni, potrebno je provesti izolaciju i potvrdu. Provedite barem jedan test provjere. Kada je rezultat tog testa negativan, smatra se da je taj uzorak negativan. U slučaju da je rezultat tog testa pozitivan, potrebno je provesti drugi ili više testova provjere, koji se temelje na različitim biološkim načelima, kako bi se potvrdio pozitivan rezultat. Ako su rezultati drugih ili ostalih testova negativni, smatra se da je taj uzorak negativan. Daljnji testovi nisu potrebni.
(4) Test imunofluorescencije (IF).
Uvijek koristite poliklonska antitijela za IF provjeru, dodatna monoklonska antitijela mogu omogućiti veću specifičnost (vidi Dio 4).
(5) PCR test.
Koristite validirane reagense i protokole za PCR (vidi Dio 6).
(6) FISH test.
Koristite validirane reagense i protokole (vidi Dio 5).
(7) Selektivna izolacija.
Korištenje MTNA ili NCP-88 hranjivih podloga i 1/100 razrijeđenja resuspendiranog taloga je u mnogim slučajevima prikladna metoda za izravnu izolaciju C. m. subsp. sepedonicus. Tipične kolonije mogu se dobiti 3 do 10 dana nakon nasađivanja na hranjivu podlogu. Patogen se tada može pročistiti i identificirati. Kako bi se u cijelosti iskoristile mogućnosti testa, potrebna je pažljiva priprema jezgre pupka kako bi se izbjegle sekundarne bakterije s gomolja krumpira, koje na hranjivoj podlozi konkuriraju bakteriji C. m. subsp. sepedonicus i mogu prerasti patogen. Ako izolacija na hranjivoj podlozi ne uspije, mora se napraviti iz biljaka koje su korištene u biotestu (vidi Dio 8).
(8) Biotest se koristi za izolaciju bakterije C. m. subsp. sepedonicus iz ekstrakta selektivnim obogaćivanjem u patlidžanima (Solanum melongena). Test zahtijeva optimalne uvjete inkubacije kao što je navedeno u ovoj metodi. Bakterije koje inhibiraju bakteriju C. m. subsp. sepedonicus na MTNA ili NCP-88 hranjivim podlogama najvjerojatnije neće smetati u ovom testu (vidi Dio 7).
(9) Tipična morfologija kolonije opisana je u Dijelu 8.
(10) Uzgoj bakterijske kulture ili biotest mogu biti neuspješni zbog kompeticije ili inhibicije saprofitnim bakterijama. Ako se testovima provjere dobiju jasno pozitivni rezultati, a rezultati izolacije su negativni, ponovite testove izolacije iz istog resuspendiranog taloga ili ponovite uzimanje provodnog tkiva iz baznog dijela blizu stolona gomolja iz istog uzorka te, ako je potrebno, testirajte dodatne uzorke.
(11) Pouzdana identifikacija čistih kultura vjerojatnih C. m. subsp. sepedonicus postiže se provođenjem testova opisanih u Dijelu 9.
(12) Test patogenosti opisan je u Dijelu 10.
1.3. Shema za detekciju i identifikaciju bakterije Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus u uzorcima biljaka krumpira bez simptoma

(1) Za preporučene veličine uzoraka vidi Dio 3.2.
(2) Metode ekstrakcije i koncentriranja patogena opisane su u Dijelu 3.2.
(3) Ako su rezultati najmanje dva testa, koji se temelje na različitim biološkim načelima, pozitivni, potrebno je provesti izolaciju i potvrdu. Provedite barem jedan test provjere. Kada je rezultat tog testa negativan, smatra se da je taj uzorak negativan. U slučaju da je rezultat tog testa pozitivan, potrebno je provesti drugi ili više testova provjere, koji se temelje na različitim biološkim načelima, kako bi se potvrdio pozitivan rezultat. Ako su rezultati drugih ili ostalih testova negativni, smatra se da je taj uzorak negativan. Daljnji testovi nisu potrebni.
(4) Selektivna izolacija i tipična morfologija kolonije opisani su u Dijelu 8.
(5) IF test opisan je u Dijelu 4.
(6) PCR testovi opisani su u Dijelu 6.
(7) FISH test opisan je u Dijelu 5.
(8) Biotest opisan je u Dijelu 7.
(9) Uzgoj bakterijske kulture ili biotest mogu biti neuspješni zbog kompeticije ili inhibicije saprofitnim bakterijama. Ako se testovima provjere dobiju jasno pozitivni rezultati, a rezultati izolacije su negativni, ponovite testove izolacije i, ako je potrebno, testirajte dodatne uzorke.
(10) Pouzdana identifikacija čistih kultura vjerojatnih C. m. subsp. sepedonicus postiže se provođenjem testova opisanih u Dijelu 9.
(11) Test patogenosti opisan je u Dijelu 10.

2. VIZUALNI PREGLED ZA OTKRIVANJE SIMPTOMA PRSTENASTE TRULEŽI

2.1. Biljke krumpira
U europskim klimatskim uvjetima simptomi se rijetko pronalaze u polju i to često tek na kraju sezone. Osim toga, simptomi su često prikriveni ili se mogu zamijeniti s drugim bolestima, starenjem ili mehaničkim oštećenjima. Stoga možemo vrlo lako previdjeti simptome prilikom pregleda u polju. Simptomi venuća vrlo su različiti od onih smeđe truleži; venuće je obično polagano i u početku ograničeno na rubove listova. Mladi zaraženi listovi često nastavljaju rasti, iako manje u zaraženim dijelovima, te su listovi neobičnog oblika. Listovi zbog blokade provodnog tkiva u donjem dijelu stabljike često imaju klorotične, žuto-narančaste dijelove između lisnih žila. Zaraženi listići, listovi, čak i stabljike mogu s vremenom odumrijeti. Često su listovi i gomolji samo manje veličine. Povremeno su biljke zakržljale. Slike u boji različitih simptoma mogu se pronaći na mrežnoj stranici:
http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/mai.
2.2. Gomolji krumpira
Najraniji simptomi su lagana staklenost ili prozirnost tkiva bez omekšanja oko provodnog sustava, osobito u blizini pupka gomolja. Provodni prsten na pupku može biti malo tamnije boje od uobičajene. Prvi lako uočljiv simptom je žućkasta boja provodnog prstena, a kada se gomolj nježno stisne, iz žila izlaze male količine sirastog materijala. Taj iscjedak sadrži milijune bakterija. Provodno tkivo može posmeđiti i simptomi na gomolju u ovom stadiju slični su simptomima smeđe truleži koju uzrokuje Ralstonia solanacearum. U početku, ti simptomi mogu biti ograničeni na jedan dio provodnog prstena, ne nužno blizu pupka, i mogu se postupno proširiti na cijeli prsten. Kako infekcija napreduje, dolazi do propadanja provodnog tkiva; vanjska i unutarnja kora se mogu razdvojiti. U naprednim stadijima infekcije, na površini gomolja pojavljuju se pukotine, koje su često crvenkasto-smeđe po rubovima. Nedavno se u Europi pojavilo nekoliko slučajeva u kojima je središte gomolja trunulo istovremeno s provodnim prstenom što je dovelo do sekundarnog napada i unutarnjim stvaranjem šupljina i nekroza. Sekundarni gljivični ili bakterijski napad može prikriti simptome i može biti teško, čak nemoguće, razlikovati uznapredovale simptome prstenaste truleži od drugih truleži gomolja. Mogući su netipični simptomi. Slike u boji različitih simptoma mogu se pronaći na mrežnoj stranici:
http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main.

3. PRIPREMA UZORKA

3.1. Gomolji krumpira
Napomena:
– Standardna veličina uzorka je 200 gomolja po testu. Intenzivnije uzorkovanje zahtijeva više testova na uzorca uzorcima te veličin broj gomolja u uzorku dovest će do inhibicije ili će otežati tumačenje rezultata. Međutim, postupak se može prikladno primijeniti za uzorke s manje od 200 gomolja, kada je na raspolaganju manje gomolja.
– Validacija svih metoda za detekciju, koje su opisane u daljnjem tekstu, temelji se na testiranju uzoraka od 200 gomolja.
– ekstrakt krumpira koji je opisan u daljnjem tekstu može se koristiti i za detekciju uzročnika smeđe truleži krumpira, bakterije Ralstonia solanacearum.
Neobvezna obrada prije pripreme uzorka
Operite gomolje. Upotrijebite prikladna dezinfekcijska sredstva (spojeve klora kada će se provesti PCR test kako bi se uklonila moguća DNK patogena) i deterdžente između svakog uzorka. Osušite gomolje na zraku. Postupak pranja je posebice koristan (ali ne obvezan) za uzorke s previše tla i ako će se provesti PCR test ili direktna izolacija.
3.1.1. Čistim i dezinficiranim skalpelom ili nožem za povrće uklonite koru na krajevima pupka gomolja tako da provodno tkivo bude vidljivo. Pažljivo izrežite malu jezgru provodnog tkiva na kraju pupka pazeći da zahvatite što manje okolnog, neprovodnog tkiva. (vidi mrežnu stranicu:
http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main).
Napomena:
Odvojite sve gomolje s mogućim simptomima prstenaste truleži i testirajte posebno.
Ako prilikom odstranjivanja jezgre pupka opazite moguće simptome prstenaste truleži, gomolj treba vizualno pregledati nakon što se prereže blizu pupka. Svaki prerezani gomolj s mogućim simptomima treba ostaviti na sobnoj temperaturi dva dana da suberizira i pohraniti u karantenskim uvjetima (na 4 do 10 °C) sve dok se ne dovrše svi testovi. Svi gomolji u uzorku (uključujući one sa sumnjivim simptomima) trebaju se čuvati u skladu s člankom 5. Pravilnika.
3.1.2. Stavite jezgre pupaka u neupotrebljene posude za jednokratnu uporabu koje se mogu zatvoriti i/ili hermetički zatvoriti (ako su posude već upotrebljavane, moraju se temeljito očistiti i dezinficirati spojevima klora). Poželjno ih je odmah obraditi. Ako to nije moguće, čuvajte ih u posudi bez dodatka pufera, najdulje 72 sata u hladnjaku ili najdulje 24 sata na sobnoj temperaturi. Sušenje i suberizacija jezgri, kao i rast saprofita tijekom pohrane mogu ometati detekciju bakterije uzročnika prstenaste truleži.
3.1.3. Obradite jezgre pupaka jednim od sljedećih postupaka:
(a) dodati dovoljnu količinu (oko 40 ml) ekstrakcijskog pufera (Dodatak 3) da pokrije jezgre pupaka i tresti na rotacijskoj tresilici (50 do 100 okretaja/min) četiri sata na temperaturi ispod 24 °C ili 16 do 24 sata uz hlađenje,
ili
(b) homogenizirajte jezgre pupaka s dovoljnom količinom (oko 40 ml) ekstrakcijskog pufera (Dodatak 3), bilo u miješalici (npr. Waring ili Ultra Thurax) bilo drobljenjem u dobro zatvorenoj vrećici za maceraciju za jednokratnu uporabu (npr. vrećice Stomacher ili Bioreba od čvrstog politena, 150 mm x 250 mm, sterilizirane zračenjem) koristeći gumeni bat ili prikladnu drobilicu (npr. Homex).
Napomena:
Ako se uzorci homogeniziraju u miješalici, postoji velika opasnost od njihove unakrsne kontaminacije. Poduzmite mjere opreza kako biste spriječili nastajanje aerosola ili razlijevanje tijekom postupka ekstrakcije. Pobrinite se da za svaki uzorak upotrijebite svježe sterilizirane nožiće i posude miješalice. Ako će se provesti PCR test, spriječite prijenos DNK na spremnike ili drobilicu. Za PCR test preporučuje se drobljenje u vrećicama za jednokratnu uporabu i korištenje epruveta za jednokratnu uporabu.
3.1.4. Odlijte supernatant. Ako je previše mutan, razbistrite ga sporim centrifugiranjem (na najviše 180 g 10 minuta na temperaturi od 4 do 10 °C) ili vakuumskom filtracijom (40 do 100 µm), i dodatno isperite filtar ekstrakcijskim puferom (oko 10 ml) (Dodatak 3).
3.1.5. Koncentrirajte bakterijsku frakciju centrifugiranjem na 7 000 g 15 minuta (ili 10 000 g 10 minuta) na temperaturi od 4 do 10 °C te odlijte supernatant pazeći pri tom da se ne pomiješa talog.
3.1.6. Resuspendirajte talog u 1,5 ml pufera za talog (Dodatak 3). Upotrijebite 500 µl za testiranje na C. m. subsp. sepedonicus, 500 µl za Ralstonia solanacearum i 500 µl kao referentni materijal. Dodajte sterilni glicerol konačnoj koncentraciji od 10 do 25 % (v/v) 500 µl referentnog alikvota i preostalom testnom alikvotu, promiješajte i uskladištite na temperaturi od –16 do –24 °C (tjednima) ili na –68 do –86 °C (mjesecima). Testne alikvote čuvajte na 4 do 10 °C tijekom testiranja.
Ne preporuča se višekratno zamrzavanje i otapanje.
Ako je potreban transport ekstrakta, osigurajte dostavu u prijenosnome hladnjaku u roku od 24 do 48 sati.
3.1.7. Sve pozitivne kontrole i uzorci C. m. subsp. sepedonicus moraju se odvojeno pripremiti i obraditi kako bi se izbjegla kontaminacija. To vrijedi za stakalca za imunofluorescenciju kao i za sve ostale testove.
3.2. Biljke krumpira
Napomena:
Za detekciju latentnih populacija bakterije R. solanacearum preporučuje se testiranje sastavljenih uzoraka. Postupak se može prikladno primijeniti na sastavljene uzorke s najviše 200 dijelova stabljika. (Ako se provode sustavna istraživanja, ona se moraju temeljiti na statistički reprezentativnom uzorku biljne populacije koja se ispituje).
3.2.1. Čistim dezinficiranim nožem ili vrtlarskim škarama odrežite dio dug 1 do 2 cm s donjeg dijela svake stabljike, odmah iznad površine tla.
Kratko dezinficirajte dijelove stabljika 70 % etanolom i odmah posušite papirnatim ručnikom.
Stavite dijelove stabljika u zatvorenu sterilnu posudu prema jednom od sljedećih postupaka:
3.2.2. Obradite dijelove stabljika pomoću jednog od sljedećih postupaka:
(a) prekrijte ih dovoljnom količinom (približno 40 ml) ekstrakcijskog pufera (Dodatak 3) i tresite na rotacijskoj tresilici (50 do 100 okretaja/min) četiri sata na temperaturi ispod 24 °C ili 16 do 24 sata uz hlađenje,
ili
(b) odmah obradite drobljenjem u čvrstoj vrećici za maceraciju (npr. Stomacher ili Bioreba) s odgovarajućom količinom ekstrakcijskog pufera (Dodatak 4) koristeći gumeni bat ili prikladnu drobilicu (npr. Homex). Ako to nije moguće, dijelove stabljika čuvajte u hladnjaku najdulje 72 sata ili na sobnoj temperaturi najdulje 24 sata.
3.2.3. Nakon 15 minuta taloženja, izlijte supernatant.
3.2.4. Dodatno bistrenje ekstrakta ili koncentriranje bakterijske frakcije obično nije potrebno, ali se može postići filtriranjem i/ili centrifugiranjem kako je opisano u dijelu 3.1.4 do 3.1.6.
3.2.5. Podijelite čisti ili koncentrirani ekstrakt uzorka na dva jednaka dijela. Jednu polovicu čuvajte na temperaturi od 4 do 10 °C tijekom testiranja, a drugu polovicu pohranite s 10-25 % (v/v) sterilnog glicerola na temperaturi od –16 do –24 °C (tjednima) ili na –68 do
–86 °C (mjesecima) u slučaju da je potrebno daljnje testiranje.

4. IF TEST

Načelo
Uporaba IF testa kao glavnog testa provjere preporuča se zbog njegove dokazane dosljednosti pri postizanju zahtijevanih pragova detekcije.
Kada se IF test koristi kao glavni test provjere i ako je IF očitanje pozitivno, mora se provesti PCR test ili FISH test kao drugi test provjere. Kada se IF test koristi kao drugi test provjere i IF očitanje je pozitivno, potrebno je daljnje testiranje prema dijagramu toka kako bi se dovršila analiza.
Napomena:
Uvijek koristite poliklonska antitijela kada se IF test koristi kao glavni test provjere. U slučaju pozitivnog IF očitanja s poliklonskim antitijelima, daljnja provjera uzorka s monoklonskim antitijelima može omogućiti veću specifičnost, ali može biti manje osjetljiva.
Upotrijebite antitijela na referentni soj C. m. subsp. sepedonicus. Preporuča se da se titar odredi za svaku novu seriju antitijela. Titar se definira kao najveće razrijeđenje kod kojeg dolazi do optimalne reakcije pri testiranju suspenzije koja sadrži 10⁵ do 09; do 10⁶ stanml homolognog soja C. m. subsp. sepedonicus uz korištenje fluorescein-izotiocijanat (FITC) konjugiranih antitijela u skladu s preporukama proizvođača. Nerazrijeđena poliklonska i monoklonska antitijela trebaju imati IF titar najmanje 1:2000. Tijekom testiranja treba koristiti radna razrijeđenja antitijela, koja su blizu ili jednaka titru. Koristite validirana antitijela
(vidi mrežnu stranicu: http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main).
Test treba provesti na svježe pripremljenim ekstraktima uzoraka. On se, po potrebi, može uspješno provesti i na ekstraktima koji su bili pohranjeni na temperaturi od – 68 do – 86 °C s dodatkom glicerola. Glicerol se može ukloniti dodavanjem 1 ml pufera za talog (Dodatak 4), ponovnim 15-minutnim centrifugiranjem na 7000 g i resuspendiranjem u jednakom volumenu pufera za talog. To je rijetko potrebno, naročito ako su uzorci plamenom fiksirani na stakalca (vidi 2.2).
Za pozitivnu kontrolu pripremite odvojena stakalca s homolognim sojem ili nekim drugim referentnim sojem bakterije C. m. subsp. sepedonicus, suspendiranim u ekstraktu krumpira kako je navedeno u Dodatku 2 te po izboru u puferu.
Kao sličnu kontrolu na istom stakalcu trebalo bi, po mogućnosti, koristiti prirodno zaraženo tkivo (održavano liofilizacijom ili zamrzavanjem na –16 do – 24 °C).
Za negativnu kontrolu mogu se upotrijebiti alikvoti ekstrakta uzoraka koji su u ranijem testiranju pokazali negativan rezultat.
Koristite predmetna stakalca sa više jažica, po mogućnosti s 10 jažica promjera najmanje 6 mm.
Kontrolni materijal testirajte jednako kao i uzorke.
4.1. Pripremite stakalca za testiranje prema jednom od sljedećih postupaka:
(i) Za taloge s relativno malo škroba:
U prvu jažicu pipetom odmjerite standardni volumen (15 µl je dovoljno za jažice promjera 6 mm – za veće jažice povećajte volumen) razrjeđenja od 1/100 resuspendiranog taloga krumpira. Potom u ostale jažice u istom redu pipetom odmjerite slični volumen nerazrijeđene suspenzije (1/1) taloga. Drugi se red može koristiti za duplikat istog ili za drugi uzorak kako je prikazano na Slici 1.
(ii) Za ostale suspenzije taloga:
Pripremite decimalna razrjeđenja (1/10, 1/100) resuspendiranog taloga u puferu za talog. U jedan red jažica pipetom odmjerite standardni volumen (15 µl je dovoljno za jažice promjera 6 mm – za veće jažice povećajte volumen) resuspendiranog taloga i svakog razrjeđenja. Drugi se red može koristiti kao duplikat istog ili za drugi uzorak kao što je prikazano na Slici 2.
4.2. Ostavite da se kapljice osuše na sobnoj temperaturi ili ih zagrijavajte do temperature od 40 do 45 °C. Fiksirajte bakterijske stanice na stakalce bilo zagrijavanjem (15 minuta na 60 °C), provlačenjem kroz plamen, 95 %-tnim etanolom ili prema posebnim uputama dobavljača antitijela.
Prije daljnjih testiranja, fiksirana se stakalca mogu, po potrebi, kratko vrijeme (najviše do tri mjeseca) čuvati zamrznuta u suhom spremniku.
4.3. IF postupak:
(i) U skladu s postupkom za pripremu stakalaca za testiranje kako je opisan pod 4.1(i):
Pripremite niz dvostrukih razrjeđenja antitijela u IF puferu. Prva jažica mora imati 1/2 titra (T/2), a ostale 1/4 titra (T/4), 1/2 titra (T/2), titar (T) i dvostruki titar (2T).
(ii) U skladu s postupkom za pripremu stakalaca za testiranje kako je opisan pod 4.1(ii):
Pripremite radno razrjeđenje antitijela u IF puferu. Radno razrjeđenje utječe na specifičnost.

4.3.1. Posložite stakalca na navlaženi upijajući papir. Svaku jažicu potpuno prekrijte razrjeđenjem antitijela. Volumen antitijela koji se stavlja u pojedinu jažicu mora biti jednak volumenu stavljenog ekstrakta.
Slijedite sljedeći postupak ako nema posebnih uputa dobavljača antitijela:
4.3.2. Inkubirajte stakalca na vlažnom papiru, pokrivena, 30 minuta na sobnoj temperaturi (18 do 25 °C).
4.3.3. Otresite kapljice sa svakog stakalca i pažljivo ih isperite IF puferom. Potopite ih 5 minuta u IF pufer-Tween (Dodatak 3) i nakon toga u IF pufer. Pazite da ne dođe do stvaranja aerosola ili prijenosa kapljica jer bi to moglo dovesti do unakrsne kontaminacije. Stakalca pažljivo osušite upijajućim papirom.
4.3.4. Posložite stakalca na navlaženi upijajući papir. Jažice prekrijte razrijeđenim FITC konjugatom koji se koristi za određivanje titra. Volumen konjugata nanesenog na jažice mora biti jednak volumenu nanesenog antitijela.
4.3.5. Inkubirajte stakalca na vlažnom papiru, pokrivena, 30 minuta na sobnoj temperaturi (18 do 25 °C).
4.3.6. Otresite kapljice konjugata sa stakalca. Isperite i operite kako je prethodno opisano (4.3.3).
Pažljivo osušite.
4.3.7. Na svaku jažicu pipetom nanesite 5-10 µl 0,1 M glicerola s fosfatnim puferom (Dodatak 3) ili sredstvo protiv izbljeđivanja koje je dostupno na tržištu te stavite pokrovno stakalce.
4.4. Očitavanje IF testa:
4.4.1. Pregledajte pripremljena stakalca pod epifluorescentnim mikroskopom s odgovarajućim filtrima za ekscitaciju FITC-a, uz uljnu imerziju i povećanje od 500-1000 x. Pregledajte svaku jažicu preko dva međusobno okomita promjera i duž vanjskog ruba. Za uzorke u kojima je vidljiv mali broj stanica ili ih uopće nema pregledajte najmanje 40 mikroskopskih vidnih polja.
Najprije pregledajte stakalce s pozitivnom kontrolom. Stanice moraju snažno fluorescirati i moraju biti potpuno obojene na utvrđenom titru antitijela ili radnog razrjeđenja. U slučaju da kod obojenosti dođe do odstupanja, IF test se mora ponoviti (Dio 4).
4.4.2. Pregledajte da li su u jažicama vidljive jasno fluorescirajuće stanice karakteristične morfologije za bakteriju C. m. subsp. sepedonicus (vidi mrežnu stranicu: http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main).
Intenzitet fluorescencije mora biti jednak ili bolji kao i kod pozitivnog kontrolnog soja pri jednakom razrjeđenju antitijela. Stanice s nepotpunim obojenjem ili sa slabom fluorescencijom moraju se zanemariti.
Test se mora ponoviti ako se sumnja na kontaminaciju. Sumnjati se može ako sva stakalca u seriji pokazuju pozitivne stanice zbog kontaminacije pufera ili ako su pozitivne stanice pronađene (izvan jažica) na površini stakalca.
4.4.3. Postoji nekoliko problema vezanih uz specifičnost testa imunofluorescencije. U koncentriranom ekstraktu krumpirovih pupaka ili dijelova stabljika mogu se nalaziti populacije fluorescirajućih stanica netipične morfologije i saprofitne bakterije s kojima dolazi do unakrsne reakcije i koje su po veličini i morfologiji slične bakteriji C. m. subsp. sepedonicus.
4.4.4. U obzir uzmite samo fluorescirajuće stanice tipične veličine i morfologije u titru ili radnom razrjeđenju antitijela kako je opisan u točki u 4.3.
4.4.5. Tumačenje očitanja IF testa:
(i) Ako nađete jasno fluorescirajuće stanice karakteristične morfologije, odredite prosječni broj tipičnih stanica po mikroskopskom vidnom polju i izračunajte broj tipičnih stanica po ml resuspendiranog taloga (Dodatak 4).
Očitanje IF testa je pozitivno za uzorke koji imaju najmanje 5 x 10³ tipičnih stanica po ml resuspendiranog taloga. Uzorak se smatra potencijalno kontaminiranim i potrebno je daljnje testiranje.
(ii) Očitanje IF testa je negativno za uzorke koji imaju manje od 5 x 10³ stanica po ml resuspendiranog taloga te se uzorak smatra negativnim. Nije potrebno daljnje testiranje.

5. FISH TEST

Načelo
Kada se FISH test koristi kao prvi test provjere i ako se njime dobije pozitivan rezultat, mora se provesti IF test kao drugi obvezni test provjere. Ako se FISH test koristi kao drugi test provjere i ako se njime dobije pozitivan rezultat, za postavljanje konačne dijagnoze treba obaviti daljnje testiranje prema dijagramu.
Napomena:
Koristite validirane oligo-probe specifične za bakteriju C. m. subsp. sepedonicus (Dodatak 7). Preliminarna tnarna testiranja ovom metodoju omogućiti ponovljivu detekciju najmanje 10³ do 10⁴ stanica bakterije C. m. subsp. sepedonicus po ml koje su dodane ekstraktima uzoraka koji su u ranijim testiranjima bili negativni.
Sljedeći je postupak najbolje provesti na svježe pripremljenim ekstraktima uzoraka, ali se može uspješno primijeniti i na ekstraktu uzorka koji je bio pohranjeni s glicerolom na temperaturi od – 16 do – 24 °C ili od – 68 do – 86 °C.
Za negativnu kontrolu upotrijebite alikvote ekstrakta uzoraka koji su u ranijem testiranju na C. m. subsp. sepedonicus bili negativni.
Za pozitivnu kontrolu pripremite suspenzije koje sadrže 10⁵ do 10⁶ stanica/ml 0,01 M fosfatnog pufera (PB) bakterije C. m. subsp. sepedonicus (npr. soj NCPPB 4053, ili PD 406) iz kulture stare 3 – 5 dana (za pripremu vidi Dodatak 2). Pripremite odvojena stakalca za pozitivnu kontrolu s homolognim sojem ili nekim drugim referentnim sojem bakterije C. m. subsp. sepedonicus, suspendiranim u ekstraktu krumpira, kao što je navedeno u Dodatku 2.
Korištenje eubakterijske oligo-probe obilježene FITC-om omogućuje kontrolu procesa hibridizacije jer će se obojiti sve eubakterije koje su prisutne u uzorku.
Kontrolni materijal testirajte jednako kao i uzorke.
5.1. Fiksiranje ekstrakta krumpira
Sljedeći protokol temelji se na Wullings i sur., (1998):
5.1.1. Pripremite otopinu za fiksiranje (vidi Dodatak 7).
5.1.2. Pipetom odmjerite 100 µl svakog ekstrakta uzorka u Eppendorf epruvetu te centrifugirajte 8 minuta na 7000 g.
5.1.3. Uklonite supernatant i resuspendirajte talog u 500 µl fiksativa pripremljenog prije najviše 24 sata. Promiješajte na vrtložnoj miješalici i inkubirajte jedan sat u hladnjaku.
Alternativni fiksativ je 96 % etanol. Pri tome je potrebno resuspendirati talog iz koraka 5.1.2 u 50 µl 0,01M PB i 50 µl 96 % etanola. Promiješajte na vrtložnoj miješalici i inkubirajte na 4 °C 30 do 60 minuta.
5.1.4. Centrifugirajte 8 minuta na 7000 g, uklonite supernatant te resuspendirajte talog u 75 µl 0,01M PB (vidi Dodatak 3).
5.1.5. U jažice čistog stakalca nanesite 16 µl fiksiranih suspenzija kako je prikazano na Slici 3. Na svako stakalce nanesite nerazrijeđena dva različita uzorka i upotrijebite 10 µl za pripremanje razrjeđenja 1:100 (u 0,01 M PB). Preostalu fiksiranu otopinu uzorka (49 µl) možete pohraniti na – 20 °C nakon dodavanja jednog volumena 96 %-tnog etanola. Ako FISH test trebate ponoviti, centrifugiranjem uklonite etanol i dodajte jednaki volumen 0,01 PB (promiješati na vrtložnoj miješalici).
Slika 3. Prikaz stakalca za FISH test

5.1.6. Stakalca osušite na zraku (ili u sušioniku na 37 °C) te ih fiksirajte provlačenjem kroz plamen.
Na ovom se koraku postupak može prekinuti i nastaviti sljedeći dan. Stakalca se trebaju pohraniti na sobnoj temperaturi u suhom prostoru bez prašine.
5.2. Predhibridizacija i hibridizacija
5.2.1. Pripremite otopinu lizozima koja sadrži 10 mg lizozima (Sigma L–6876) u 10 ml pufera (100 mM Tris-HCl, 50 mM EDTA, pH 8,0). Ta se otopina može pohraniti, ali se smije samo jednom odmrznuti i otopiti. Dobro prekrijte svaki uzorak s približno 50 µl otopine lizozima i inkubirajte 10 minuta na sobnoj temperaturi. Zatim samo jednom umočite objektna stakalca u demineraliziranu vodu i pažljivo osušite filtar papirom.
Alternativno umjesto lizozima dodajte 50 µl 40 do 400µg ml–1 proteinaze K u puferu (20 mM Tris-HCl, 2 mM CaCl2, pH 7,4) na svaku jažicu i inkubirajte na 37 °C 30 minuta.
5.2.2. Dehidrirajte stanice uzastopnim jednominutnim uranjanjem u 50 %-tni, 80 %-tni i 90 %-tni etanol. Stakalca postavite na držač i osušite na zraku.
5.2.3. Pripremite vlažnu komoru za inkubaciju tako što ćete dno hermetičke kutije prekriti upijajućim ili filtar papirom namočenim u 1x hybmix (Dodatak 7). Kutiju prethodno inkubirajte u hibridizacijskoj pećnici na 55 °C najmanje 10 minuta.
5.2.4. Pripremite 45 µl hibridizacijske otopine po stakalcu (Dodatak 7) i prethodno inkubirajte pet minuta na 55 °C.
5.2.5. Stavite stakalca na grijaću podlogu na 45 °C i nanesite po 10 µl hibridizacijske otopine na svaku od četiri jažice.
5.2.6. Stavite dva pokrovna stakalca (24 × 24 mm) na svako stakalce pazeći pri tom da u jažicama ne ostane zraka. Stavite stakalca u prethodno zagrijanu vlažnu komoru i hibridizirajte preko noći u pećnici na 55 °C.
5.2.7. Pripremite tri posude sa 1 L ultra čiste vode, 1 L 1x hybmix (334 ml 3x hybmix i 666 ml ultra čiste vode) i 1 L 1/2x hybmix (167 ml 3x hybmix i 833 ml ultra čiste vode). Svaku posudu prethodno inkubirajte u vodenoj kupelji na 55 °C.
5.2.8. Skinite pokrovna stakalca, a predmetna stakalca stavite na držač.
5.2.9. Višak probe isperite inkubiranjem 15 minuta na 55 °C u posudi s 1x hybmixa.
5.2.10. Prenesite držač stakalaca u otopinu za pranje (1/2 x hybmix) i inkubirajte još 15 minuta.
5.2.11. Stakalca nakratko uronite u ultra čistu vodu te ih stavite na filtar papir. Višak vlage uklonite tako što ćete površinu lagano pokriti filtar papirom. U svaku jažicu pipetom nanesite 5 do 10 µl zaštitne otopine protiv izbljeđivanja (npr. Vectashield, Vecta Laboratories, CA, USA ili ekvivalentna) te cijelo predmetno stakalce pokrijte velikim pokrovnim stakalcem (24 x 60 mm).
5.3. Očitavanje FISH testa
5.3.1. Stakalca odmah pregledajte epifluorescentnim mikroskopom uz uljnu imerziju, s povećanjem od 630 ili 1000 x. S filtrom prikladnim za fluorescein-izotiocijanat (FITC), eubakterijske stanice (uključujući većinu gram negativnih stanica) u uzorku vide se kao fluorescentno zelene. Uporabom filtra za tetrametilrodamin-5-izotiocijanat stanice bakterije C. m. subsp. sepedonicus, obojene s Cy 3, vide se kao fluorescentno crvene. Usporedite morfologiju stanice s morfologijom pozitivnih kontrola. Stanice moraju biti jasno flourescentne i u cijelosti obojene. Ako dođe do odstupanja u obojenosti, FISH test (Dio 9.4) se mora ponoviti. Pregledajte svaku jažicu duž dva međusobno okomita promjera i duž vanjskog ruba. Za uzorke u kojima je vidljiv mali broj stanica ili ih uopće nema pregledajte najmanje 40 mikroskopskih vidnih polja.
5.3.2. Pregledajte da li su u jažicama vidljive jasno fluorescirajuće stanice karakteristične morfologije za bakteriju C. m. subsp. sepedonicus (vidi mrežnu stranicu: http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main).
Intenzitet fluorescencije mora biti jednak ili bolji nego na soju pozitivne kontrole. Stanice koje nisu u potpunosti obojene ili su slabe fluorescencije ne smiju se uzeti u obzir.
5.3.3. Test se mora ponoviti ako se sumnja na kontaminaciju. Sumnjati se može ako sva stakalca u seriji pokazuju pozitivne stanice zbog kontaminacije pufera ili ako su pozitivne stanice pronađene (izvan jažica) na površini stakalca.
5.3.4. Postoji nekoliko problema vezanih uz specifičnost FISH testa. U koncentriranom ekstraktu krumpirovih pupaka i dijelova stabljika mogu se pojaviti, iako rjeđe nego kod IF testa, populacije fluorescirajućih stanica netipiče morfologije i saprofitne bakterije koje su po veličini i morfologiji slične bakteriji C. m. subsp. sepedonicus.
5.3.5. U obzir uzmite samo fluorescirajuće stanice tipične veličine i morfologije, vidi 5.3.2.
5.3.6. Tumačenje rezultata testa FISH:
(i) Rezultati FISH testa smatraju se valjanim ako se primjenom FITC filtra opaze zeleno fluorescirajuće stanice čija je veličina i morfologija tipična za bakteriju C. m. subsp. sepedonicus i ako se primjenom filtra za rodamin opaze crveno fluorescirajuće stanice, i to u svim pozitivnim kontrolama i niti jednoj negativnoj kontroli. Ako se pronađu jasno fluorescirajuće stanice karakteristične morfologije, odredite prosječni broj tipičnih stanica po mikroskopskom vidnom polju i izračunajte broj tipičnih stanica po ml resuspendiranog taloga (Dodatak 4). Uzorci s najmanje 5 x 10³ tipič; tipičnih stanica po ml resuspen taloga smatraju se potencijalno kontaminiranima. Potrebni su daljnji testovi. Uzorci s manje od 5 x 10³ tipičnih stanica po ml resuspendiranog taloga smatraju se negativnima.
(ii) FISH Test je negativan ako se primjenom filtra za rodamin ne uoče snažno fluorescirajuće crvene stanice čija je veličina i morfologija tipična za bakteriju C. m. subsp. sepedonicus, pod uvjetom da se primjenom filtra za rodamin uoče tipične snažno fluorescirajuće crvene stanice u preparatima pozitivne kontrole.

6. PCR TEST

Načela
Kada se PCR test koristi kao glavni test provjere i rezultat je pozitivan, mora se provesti IF test izolacija kao drugi obvezni test provjere. Kada se PCR test koristi kao drugi test provjere i rezultat je pozitivan, za postavljanje konačne dijagnoze potrebno je daljnje testiranje prema dijagramu.
Korištenje ove metode kao glavnog testa provjere preporučuje se samo ako ste stručno osposobljeni.
Napomena:
Preliminarno testiranje ovom metodom treba omogućiti ponovljivu detekciju 10³ do 10⁴ stanica bakterije C. m. subsp. sepedonicus po ml, koje su dodane ekstraktima uzoraka koji su u prethodnim testiranjima dali negativni rezultat. Kako bi se postigao najveći stupanj osjetljivosti i specifičnosti u svim laboratorijima, mogu biti potrebni pokusi za optimizaciju metode.
Koristite validirane reagense i protokole za PCR. Poželjno je odabrati metodu s internom kontrolom.
Poduzmite odgovarajuće mjere opreza kako biste izbjegli kontaminaciju uzorka ciljnom DNK. Da bi se spriječila kontaminacija ciljnom DNK, PCR test trebali bi obavljati iskusni stručnjaci, u specijaliziranim laboratorijima za molekularnu biologiju.
Negativne kontrole (za ekstrakciju DNK i PCR postupak) treba uvijek obraditi kao zadnje uzorke u postupku kako bi se vidjelo je li došlo do prijenosa DNK.
U PCR test treba uključiti sljedeće negativne kontrole:
– ekstrakt uzorka koji je u ranijem testiranju na C. m. subsp. sepedonicus bio negativan,
– pufer korišten za ekstrakciju bakterije i DNK iz uzorka,
– reakcijsku smjesu za PCR.
Treba uključiti sljedeće pozitivne kontrole:
– alikvote resuspendiranih taloga u koje je dodana bakterija C. m. subsp. sepedonicus (za pripremu vidi Dodatak 2),
– suspenziju u vodi od 10⁶ stanica po ml C. m. subsp. sepedonicus virulentnog izolata (npr. NCPPB 2140 ili NCPPB 4053),
– ako je moguće, u PCR testu upotrijebite i DNK ekstrahiranu iz pozitivnih kontrolnih uzoraka.
Da bi se izbjegla moguća kontaminacija, pozitivne kontrole pripremite prostorno odvojeno od uzoraka za testiranje.
Ekstrakti uzoraka moraju sadržavati što je moguće manje tla. Ako namjeravate primjenjivati PCR protokole, u nekim bi slučajevima, stoga, bilo preporučljivo oprati gomolje prije pripreme ekstrakta.
6.1. Metode pročišćavanja DNK
Koristite uzorke za pozitivnu i negativnu kontrolu kako je gore opisano.
Pripremite kontrolni materijal na jednaki način kao i uzorke.
Postoje različite metode za pročišćavanje ciljne DNK iz kompleksnih uzoraka, kojima se uklanjaju inhibitori PCR reakcije i drugih enzimskih reakcija te se u ekstraktu uzorka koncentrira ciljna DNK.
Sljedeća je metoda optimizirana za korištenje s validiranom PCR metodom koja je navedena u Dodatku 6.
6.1.(a) Metoda prema Pastriku (2000)
1. Pipetom odmjerite 220 µl pufera za lizu [100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 1 mM EDTA (pH 8,0)] u Eppendorf epruvetu od 1,5 ml.
2. Dodajte 100 µl ekstrakta uzorka i stavite u blok za zagrijavanje ili vodenu kupelj na 95 °C 10 minuta.
3. Stavite epruvetu na led na pet minuta.
4. Dodajte 80 µl osnovne otopine lizozima (50 mg lizozima po ml u 10 mM Tris HCl, pH 8,0) i inkubirajte na 37 °C 30 minuta.
5. Dodajte 220 µl Easy DNA® otopine A (Invitrogen), dobro promiješajte na vrtložnoj miješalici i inkubirajte na 65 °C 30 minuta.
6. Dodajte 100 µl Easy DNA® otopine B (Invitrogen), snažno miješajte na vrtložnoj miješalici sve dok precipitat ne bude slobodno kružio po epruveti i dok uzorak ne bude jednoliko viskozan.
7. Dodajte 500 µl kloroforma te miješajte na vrtložnoj miješalici dok se viskoznost ne smanji i smjesa postane homogena.
8. Centrifugirajte na 15 000 g 20 minuta na 4 °C da se odijele faze i stvori interfaza.
9. Prenesite gornju fazu u novu Eppendorfovu epruvetu.
10. Dodajte 1 ml 100 % etanola (–20 °C), kratko promiješajte na vrtložnoj miješalici i inkubirajte na ledu 10 minuta.
11. Centrifugirajte na 15 000 g 20 minuta na 4 °C te uklonite etanol.
12. Dodajte 500 µl 80 % etanola (–20 °C) i promiješajte okretanjem epruvete.
13. Centrifugirajte na 15 000 g 10 minuta na 4 °C, sačuvajte talog, a etanol uklonite.
14. Ostavite talog da se suši na zraku ili u vakuumskoj centrifugi (DNA speed vac).
15. Resuspendirajte talog u 100 µl sterilne ultra čiste vode i ostavite na sobnoj temperaturi najmanje 20 minuta.
16. Pohranite na –20 °C sve dok nije potreban za PCR.
17. Centrifugiranjem izdvojite mogući bijeli precipitat te za PCR upotrijebite 5 µl supernatanta koji sadrži DNK.
6.1.(b) Druge metode
Mogu se primijeniti druge metode za ekstrakciju DNK (npr. Qiagen DNeasy Plant Kit) ako su dokazano jednako učinkovite u pročišćavanju DNK iz kontrolnih uzoraka koji sadrže 10³ do 10⁴ patogenih stanica po ml.
6.2. PCR
6.2.1. Pripremite kalupe za testiranje i kontrolu za PCR prema validiranim protokolima (Dodatak 6). Pripremite jedno decimalno razrjeđenje ekstrakta DNK iz uzorka (1:10 u ultra čistoj vodi).
6.2.2. U nekontaminiranom prostoru pripremite odgovarajuću reakcijsku smjesu za PCR prema objavljenim protokolima (Dodatak 6). Validirani protokol za multipleks PCR uključuje unutarnju kontrolu.
6.2.3. Dodajte 5 µl ekstrakta DNK na 25 µl reakcijske smjese u sterilne epruvete za PCR.
6.2.4. Uključite i uzorak za negativnu kontrolu koji sadrži samo reakcijsku smjesu za PCR te, umjesto uzorka, dodajte isti izvor ultra čiste vode koji je korišten za pripremu reakcijske smjese za PCR.
6.2.5. Stavite epruvete u uređaj za PCR (thermal cycler) koji je korišten u preliminarnom testiranju te pokrenite optimizirani PCR program (Dodatak 6).
6.3. Analiza PCR produkata
6.3.1. Elektroforezom u agaroznom gelu razdvojite umnožene PCR produkte. Najmanje 12 µl reakcijske smjese umnožene DNK iz svakog uzorka, pomiješane s 3 µl pufera za nanošenje (Dodatak 6), nanesite u 2,0 %-tni (w/v) agarozni gel u tris-acetat EDTA puferu (TAE) (Dodatak 6), uz napon od 5 do 8 V po cm. Upotrijebite odgovarajući DNK standard, npr. 100 bp ljestvicu.
6.3.2. Obojite elektroforetske pruge DNK u gelu etidijevim bromidom (0,5 mg/l) 30 do 45 minuta poduzimajući pri tomu odgovarajuće mjere opreza za rad s ovim mutagenom.
6.3.3. Obojeni gel pregledajte na kratkovalnom UV transiluminatoru (npr. λ = 302 nm) i tražite umnožene fragmente očekivane dužine (Dodatak 6) te ih dokumentirajte.
6.3.4. Za svaki novi nalaz/slučaj provjerite autentičnost umnoženog PCR produkta analizom restrikcijskim enzimima preostale umnožene DNK uzorka i to inkubacijom pri optimalnoj temperaturi i u optimalnom vremenu s odgovarajućim enzimom i puferom (vidi Dodatak 6). Pocijepane fragmente razdvojite elektroforezom u agaroznom gelu kako je gore navedeno te nakon bojenja etidijevim bromidom na UV transilumintoru promatrajte karakteristični restrikcijski obrazac i usporedite ga s pozitivnom kontrolom prije i poslije cijepanja.
Tumačenje rezultata PCR testa:
PCR test je negativan ako u testiranom uzorku nije vidljiv PCR produkt očekivane dužine koji je specifičan za bakteriju C. m. subsp. sepedonicus, ali je vidljiv u svim pozitivnim kontrolnim uzorcima (kod multipleks PCR-a s početnicama za unutarnju kontrolu koje su specifične za biljku domaćina: u testiranom se uzorku mora umnožiti drugi prodgi produkt PCR-a očekivane veličine PCR test je pozitivan ako je vidljiv PCR produkt koji je specifičan za bakteriju C. m. subsp. sepedonicus i koji je očekivane dužine i restrikcijskog obrasca, pod uvjetom da nije umnožen u nijednom uzorku negativne kontrole. Pouzdanu potvrdu pozitivnog rezultata možete dobiti i ponavljanjem testa s drugim parom početnica (Dio 9.3).
Napomena:
Može se sumnjati da je došlo do inhibicije PCR reakcije ako se iz uzorka pozitivne kontrole koji sadrži C. m. subsp. sepedonicus u vodi dobije očekivani produkt, a iz pozitivnih kontrola s C. m. subsp. sepedonicus u ekstraktu krumpira dobiju negativni rezultati. U multipleks PCR protokolima s unutarnjim kontrolama, inhibicija reakcije je indicirana ako nije dobiven niti jedan od dva produkta.
Ako se iz jedne ili više negativnih kontrola dobije očekivani produkt, može se sumnjati da je došlo do kontaminacije.

7. BIOTEST

Napomena:
Preliminarno testiranje ovom metodom treba omogućiti ponovljivu detekciju 10³ do 10⁴ jedinica koje stvaraju kolonije (CFU) bakterije C. m. subsp. sepedonicus po ml, a koje su dodane ekstraktima uzoraka koji su u ranijem testiranju bili negativni (za pripremu vidi Dodatak 2).
Najveća osjetljivost detekcije može se očekivati ako se koriste svježe pripremljeni ekstrakti uzoraka te optimalni uvjeti rasta. Međutim, ova se metoda može uspješno primijeniti i s ekstraktima koji su bili pohranjeni s glicerolom na temperaturi od – 68 do – 86 °C.
Neke sorte patlidžana su odlične kao selektivni medij za obogaćivanje za rast C. m. subsp. sepedonicus, čak i kad nema simptoma, a ujedno su i odlične kao domaćini za test potvrde.
Uvjeti rasta trebaju biti optimalni kako bi se smanjio rizik od lažno negativnih rezultata.
Za detalje o uzgoju vidi Dodatak 8.
7.1. Na patlidžane rasporedite sav preostali alikvot resuspendiranog taloga ostavljen za testiranje iz dijela 3.1.6 ili 3.2.5 jednom od metoda koje su navedene niže u tekstu (7.3 ili 7.4). Koristite samo biljke u stadiju dva do tri prava lista, do potpune razvijenosti trećeg pravog lista. Kako bi se u potpunosti iskoristio resuspendirani talog te osigurala učinkovita inokulacija, za postupke navedene niže u tekstu bit će potrebno 15 do 25 biljaka patlidžana po jednom uzorku.
7.2. Nemojte zalijevati patlidžane jedan do dva dana prije inokulacije kako bi se smanjio turgor.
7.3. Inokulacija zarezivanjem
7.3.1. Držeći biljku među prstima, pipetom nanesite kapljicu (oko 5-10 µl) resuspendiranog taloga na stabljiku između supki i prvog lista.
7.3.2. Sterilnim skalpelom napravite dijagonalni rez, dug oko 1 cm i dubok oko 2/3 debljine stabljike, počevši od nanešene kapljice resuspendiranog taloga.
7.3.3. Čvrsto zatvorite rez sterilnim vazelinom iz štrcaljke.
7.4. Inokulacija injekcijom
Inokulirajte stabljike patlidžana neposredno iznad supki injekcijom s potkožnom iglom (najmanje 23G). Uzorak rasporedite na testne patlidžane.
7.5. Za pozitivnu kontrolu, inokulirajte 5 biljaka suspenzijom u vodi od 10⁵ do 10⁶ stanica po ml poznate kulture C. m. subsp. sepedonicus i, kada je moguće, ekstraktom prirodno zaraženih tkiva gomolja (vidi Dio 4) istom metodom inokulacije (7.3 ili 7.4).
7.6. Za negativnu kontrolu, inokulirajte 5 biljaka sterilnim puferom za talog istom metodom inokulacije (7.3 ili 7.4).
7.7. Uzgajajte biljke u karantenskim prostorijama do četiri tjedna na 18 do 24 °C, uz dovoljnu količinu svjetla i visoku vlagu (70 do 80 %) i primjereno zalijevajte kako bi spriječili nakupljanje vode ili uvenuće zbog nedostatka vode. Stanice C. m. subsp. sepedonicus ugibaju na temperaturama iznad 30 °C, a optimalna temperatura je 21 °C. Kako bi izbjegli unakrsnu kontaminaciju, biljke pozitivne i negativne kontrole uzgajajte na jasno odvojenim stolovima u stakleniku ili policama u komori za rast ili, u slučaju da je prostor ograničen, pobrinite se da su strogo odvojene između pojedinih postupaka. Ako se biljke za različite uzorke moraju uzgajati blizu jedna drugoj, razdvojite ih prikladnim zaslonima. Kod prihrane, zalijevanja, pregledavanja i svakog drugog postupka s biljkama dobro pazite da ne dođe do unakrsne kontaminacije. Od ključne je važnosti da u staklenicima i komorama za uzgoj ne bude nikakvih insekata jer oni mogu prenijeti bakteriju s uzorka na uzorak.
7.8. Nakon jednog tjedna redovito provjeravajte pojavu simptoma. Prebrojite biljke koje pokazuju simptome. C. m. subsp. sepedonicus uzrokuje venuće lišća kod patlidžana koje može početi kao uvenulost rubova ili između žila listova. Uvenulo tkivo može u početku izgledati tamnozeleno ili prošarano, ali postaje blijedo prije nego što postane nekrotično. Uvenulost između lisnih žila često izgleda masno, kao da su natopljeni vodom. Nekrotično tkivo često ima svjetložuti rub. Biljke ne ugibaju uvijek; što je razdoblje prije nego što se simptomi razviju duže, to je veća mogućnost preživljavanja. Biljke mogu prerasti zarazu. Mlade biljke patlidžana mnogo su osjetljivije na niske populacije C. m. subsp. sepedonicus nego starije biljke; zbog toga se koriste biljke u ili neposredno prije faze tri prava lista.
Uvenuće može biti uzrokovano populacijama drugih bakterija ili gljivica koje su prisutne u ekstraktu tkiva gomolja. To su: Ralstonia solanacearum, Erwinia carotovora subsp. carotovora i E. carotovora subsp. atroseptica, Erwinia chrysanthemi, Phoma exigua var. foveata, kao i velike populacije saprofitskih bakterija. Posebice Erwinia chrysanthemi može uzrokovati simptome na listovima i venuće koje je vrlo slično simptomima C. m. subsp. sepedonicus. Jedina razlika je crnjenje stabljika u slučaju infekcija bakterijom Erwinia chrysanthemi. Druga venuća mogu se razlikovati od onih koje uzrokuje C. m. subsp. sepedonicus zato što cijeli listovi ili cijele biljke vrlo brzo venu. Može se pripremiti i bojenje po Gramu: time će se razlučiti C. m. subsp. sepedonicus od Erwinia spp.
7.9. Čim primijetite simptome kod patlidžana, potrebno je izvršiti ponovnu izolaciju, koristeći dijelove uvenulog tkiva lišća ili tkiva stabljike (vidi 3.1.3 za maceraciju tkiva). Površinski dezinficirajte lišće i stabljike patlidžana tako da ih obrišete 70 %-tnim etanolom. Provedite IF ili PCR test na soku patlidžana i izolirajte na prikladnoj (selektivnoj) hranjivoj podlozi (vidi Dio 8). Može se pripremiti i bojenje po Gramu (Dodatak 9). Identificirajte pročišćene kulture vjerojatne C. m. subsp. sepedonicus i potvrdite patogenost (vidi Dio 9 i 10).
7.10. U određenim okolnostima, osobito kad uvjeti za rast nisu optimalni, moguće je da C. m. subsp. sepedonicus postoji kao latentna infekcija u patlidžanima čak i nakon razdoblja inkubacije do 4 tjedna. Ako se simptomi ne primijete nakon 4 tjedna, provedite IF/PCR test na sastavljenom uzorku dijelova stabljike od 1 cm svake testne biljke, uzetih iznad mjesta inokulacije. Ako je test pozitivan, potrebno je provesti ponovnu izolaciju na prikladnoj (selektivnoj) hranjivoj podlozi, prema postupku iz Dijela 8. Identificirajte pročišćene kulture vjerojatne C. m. subsp. sepedonicus i potvrdite patogenost (vidi Dio 9 i 10).
Tumačenje rezultata biotesta.
Rezultati biotesta su valjani ako biljke pozitivne kontrole pokazuju tipične simptome, ako se iz tih biljaka može ponovo izdvojiti bakterija, i ako se na negativnim kontrolama ne pronađu nikakvi simptomi.
Biotest je negativan ako testne biljke nisu zaražene bakterijom C. m. subsp. sepedonicus, pod uvjetom da je bakterija C. m. subsp. sepedonicus detektirana u pozitivnim kontrolama.
Biotest je pozitivan ako su testne biljke zaražene bakterijom C. m. subsp. sepedonicus.

8. IZOLACIJA C. m. subsp. sepedonicus

Napomena:
Dijagnoza se može potvrditi samo ako se C. m. subsp. sepedonicus izolira i zatim identificira (vidi Dio 9), te ako se potvrdi patogenost (Dio 10). Iako je C. m. C. m. subsp. sepedonicus zahtjevnizam, može se izolirati iz simptomatskog tkiva.
Međutim, mogu ga prerasti brzo rastuće saprofitske bakterije te su stoga izolacije izravno iz ekstrakta tkiva gomolja ili stabljike teške (Dio 3.1.6 ili 3.2.5). Selektivnom hranjivom podlogom i prikladno razrijeđenom otopinom resuspendiranog taloga iz jezgre pupka ili stabljika krumpira moguća je izravna izolacija C. m. subsp. sepedonicus.
Izolacije je potrebno izvršiti iz svih gomolja ili dijelova stabljike krumpira sa simptomima te iz testnih patlidžana kod kojih nisu primijećeni simptomi ali je IF/PCR test iz sastavljenog uzorka bio pozitivan (vidi Dio 7.10). Maceriranje stabljika patlidžana treba se, prema potrebi, provoditi kao što je navedeno u Dijelu 3.1.3.
Za pozitivne kontrole, pripremite decimalna razrijeđenja suspenzije 10⁶ cfu po ml C. m. subsp. sepedonicus (npr. NCPPB 4053 ili PD 406). Kako bi izbjegli svaku mogućnost kontaminacije, pripremite pozitivne kontrole potpuno odvojeno od uzoraka koji se testiraju.
Za svaku svježe pripremljenu seriju selektivne hranjive podloge potrebno je provjeriti njezinu prikladnost za rast patogena prije nego što se upotrijebi za testiranje rutinskih uzoraka.
Testirajte kontrolni materijal na isti način kao i uzorak ili uzorke.
8.1. Uzgoj na selektivnoj hranjivoj podlozi
8.1.1. Iz 100 µl alikvota iz uzorka resuspendiranog taloga krumpira ili biljnog soka patlidžana pripremite decimalna razrijeđenja u puferu za talog (Dodatak 3).
8.1.2. Izolacija iz nerazrijeđenog resuspendiranog taloga krumpira obično ne uspije zbog teškog uzgoja C. m. subsp. sepedonicus i kompeticije saprofita. S obzirom da je bakterija obično prisutna u visokim populacijama u zaraženom tkivu, saprofiti se obično mogu odstraniti razrjeđivanjem, dok patogen ostaje. Stoga se preporuča razmazati 100 µl iz svakog uzorka (kod upotrebe petrijevih zdjelica promjera 90 mm – prilagodite količinu za petrijeve zdjelice drugih veličina), 1/100 do 1/10 000 razrijeđene suspenzije na hranjivu podlogu MTNA ili na NCP-88 (Dodatak 5), tehnikom razmaza.
Napomena:
Alternativna strategija je da razmažete početni alikvot po 100 µl resuspendiranog taloga krumpira na prvu podlogu, a zatim istim štapićem napravite razmaz na drugu podlogu, pri čemu na drugu podlogu nanosite ostatke ekstrakta s prve podloge. Na kraju to ponovite s trećom podlogom, čime dobivate sličan efekt razrjeđenja.
8.1.3. Inkubirajte podloge u mraku na 21 do 23 °C.
8.1.4. Prva provjera podloga i procjena kolonija sličnih C. m. subsp. sepedonicus, u usporedbi s kontrolnim podlogama, je nakon 3 dana, a daljnje procjene nakon 5, 7, te eventualno 10 dana.
8.2. Pročišćavanje sumnjivih kolonija
Napomena:
Kolonije slične C. m. subsp. sepedonicus treba precijepiti na hranjivu podlogu YGM ako će se koristiti za inokulaciju patlidžana i/ili daljnju identifikaciju; to se treba učiniti prije nego podloge postanu previše zaraštene, odnosno najbolje nakon tri do pet dana.
8.2.1. Razmažite kolonije slične C. m. subsp. sepedonicus na jednu od sljedećih hranjivih podloga: (sastavi su navedeni u Dodatku 5):
hranjivi agar s dodatkom dekstroze (koristi se samo za precjepljivanje)
agar s dodatkom kvasca, peptona i glukoze,
agar s dodatkom ekstrakta kvasca i mineralnih soli.
Inkubirajte na 21 °C do 24 °C do 10 dana.
C. m. subsp. sepedonicus sporo raste, obično stvara kremaste, kupolaste kolonije sa šiljatim vrhom unutar 10 dana. Fotografije tipičnih kolonija C. m. subsp. sepedonicus (vidi mrežnu stranicu:
http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main).
8.2.2. Ponovno razmažite kako bi postigli čistoću.
Stopa rasta se poboljšavaju precjepljivanjem. Tipične kolonije su kremasto-bijele ili poput bjelokosti, ponekad žute, zaokružene, glatke, povišene, konveksno-kupolaste, sluzavo-tekuće, s cijelim rubovima i obično 1 do 3 mm u promjeru.
Jednostavno bojenje po Gramu (Dodatak 9) može pomoći pri odabiru kolonija za daljnje testiranje.
8.2.3. Identificirajte vjerojatne kulture (vidi Dio 9) i provedite test patogenosti (vidi Dio 10).

9. IDENTIFIKACIJA

Identificirajte čiste kulture vjerojatnih izolata C. m. subsp. sepedonicus uporabom najmanje dva od sljedećih testova koja se temelje na različitim biološkim načelima.
Prema potrebi, uključite poznate referentne sojeve za svaki test.
9.1. Nutritivni i enzimatski testovi za identifikaciju
Odredite sljedeća fenotipska svojstva koja su univerzalno prisutna ili odsutna kod bakterije C. m. subsp. sepedonicus, prema metodama iz Lelliott i Stead (1987.), Klement i sur. (1990.), Schaad (2001.), nepoznati autor (1987.).
Sve se hranjive podloge trebaju inkubirati na 21 °C i pregledati nakon šest dana. Ako ne dođe do rasta, inkubirajte do 20 dana.
U sve testove treba uključiti poznatu kontrolu C. m. subsp. sepedonicus. Nutritivni i fiziološki testovi trebaju se provesti koristeći kulture s hranjivog agara. Morfološke usporedbe trebaju se napraviti iz kultura na hranjivom agaru s dodatkom dekstroze.
 

Rast na 37 °C

9.2. IF test
(a) Pripremite suspenziju od približno 10⁶ stanica po ml u IF puferu (Dodatak 3).
(b) Pripremite dvostruka razrjeđenja otopine prikladnog seruma.
(c) Primijenite IF postupak (Dio 4).
(d) IF test je pozitivan ako je IF titar kulture jednak titru pozitivne kontrole.
9.3. PCR test
(a) Pripremite suspenziju od približno 10⁶ stanica po ml u ultra čistoj vodi.
(b) Zagrijte 100 µl stanične suspenzije u zatvorenim epruvetama u bloku za zagrijavanje ili vreloj vodenoj kupelji četiri minute na 100 °C. Prema potrebi, dodavanje svježe pripremljenog NaOH do konačne koncentracije 0,05M može pomoći lizi stanica. Uzorci se mogu potom, do uporabe, pohraniti na – 16 do – 24 °C.
(c) Upotrijebite prikladne PCR postupke za umnožavanje specifičnih fragmenata C. m. subsp. sepedonicus (npr. Pastrik, 2000; vidi Dodatak 4; Li i de Boer, 1995; Mills i sur., 1997; Pastrik i Rainey, 1999; Schaad i sur., 1999.)
(d) Identifikacija C. m. subsp. sepedonicus je pozitivna ako su PCR produkti iste veličine i imaju iste polimorfizme dužina restrikcijskih fragmenata kao i pozitivni kontrolni soj.
9.4. Test FISH
(a) Pripremite suspenziju od približno 10⁶ stanica po ml u ultra čistoj vodi.
(b) Primijenite FISH postupak (Dio 5).
(c) FISH test je pozitivan ako su postignute iste reakcije iz kulture i pozitivne kontrole.
9.5. Profiliranje masnih kiselina (FAP)
(a) Uzgajajte kulturu na triptikaza-soja-agaru (Oxoid) 72 sata na
21 °C (+/– 1 °C).
(b) Primijenite prikladan FAP postupak (Janse, 1991; Stead, 1992).
(c) FAP test je pozitivan ako je profil vjerojatne kulture identičan profilu pozitivne kontrole. Prisutnost karakterističnih masnih kiselina: 15:1 Anteiso A, 15:0 Iso, 15:0 Anteiso, 16:0 Iso, 16:0 i 17:0 Anteiso, u velikoj mjeri ukazuje na C. m. subsp. sepedonicus. Drugi rodovi kao što su Curtobacterium, Arthrobacter i Micrococcus također imaju neke od ovih kiselina, ali 15:1 Anteiso A je rijetka kiselina u tim bakterijama, ali se pojavljuje u svim bakterijama Clavibacter spp. između 1 do 5 %. Kod C. m. sC. m. subsp. sepedonicus vrijednostbično oko 5 %.
9.6. BOX-PCR
(a) Pripremite suspenziju od približno 10⁶ stanica po ml u ultra čistoj vodi.
(b) Primijenite test u skladu s postupkom (Smith i sur., 2001).

10. TEST POTVRDE

Test patogenosti mora se provesti kao konačna potvrda dijagnoze C. m. subsp. sepedonicus i za procjenu virulentnosti kultura identificiranih kao C. m. subsp. sepedonicus:
10.1. Pripremite inokulum od približno 10⁶ stanica po ml iz trodnevnih kultura izolata koji se testira i prikladan soj pozitivne kontrole C. m. subsp. sepedonicus.
10.2. Inokulirajte stabljike 5 do 10 mladih sadnica patlidžana u fazi 3 prava lista (Dio 7.3 ili 7.4).
10.3. Inkubirajte na 18 do 24 °C uz dovoljnu količinu svjetla i visoku relativnu vlagu te prikladno zalijevajte kako bi izbjegli nakupljanje vode ili stres od suše (Dio 7.7). Kod čistih kultura, tipično bi se venuće trebalo pojaviti u roku od dva tjedna, ali biljke koje ne pokazuju simptome (vidi Dio 7.8) nakon tog vremena trebaju se inkubirati do tri tjedna na temperaturama koje su povoljne za rast patlidžana, ali ne više od 25 °C (Dodatak 8). Ako simptomi nisu prisutni ni nakon tri tjedna, kultura se ne može potvrditi kao patogeni oblik C. m. subsp. sepedonicus.
10.4. Izolirajte iz biljaka sa simptomima tako da odstranite dio stabljike 2 cm iznad mjesta inokulacije. Usitnite i suspendirajte u maloj količini sterilne destilirane vode ili 50 mM fosfatnog pufera (Dodatak 3). Izolirajte iz suspenzije razmazom na MTNA i YPGA (Dodatak 5), inkubirajte tri do pet dana na 21 do 23 °C i pregledajte jesu li narasle tipične kolonije bakterije C. m. subsp. sepedonicus.

Dodatak 1

Laboratoriji koji su uključeni u optimizaciju
i validaciju protokola
 

Dodatak 2

Priprema pozitivnih i negativnih kontrola za osnovne testove provjere, PCR/IF i FISH
Uzgojite 72-satnu kulturu virulentnog soja bakterije C. m. subsp. sepedonicus (NCPPB 4053 ili PD 406) na MTNA osnovnoj hranjivoj podlozi i suspendirajte u 10 mM fosfatnom puferu da dobijete gustoću stanica od približno 1 do 2 × 108 cfu po ml. To je obično slabo mutna suspenzija optičke gustoće od 0,20 na 600 nm.
Odstranite jezgre pupaka iz 200 gomolja krumpira sorte s bijelom korom za koje je poznato da je nisu zaraženi bakterijom C. m. subsp. sepedonicus.
Obradite pupke uobičajenom metodom i resuspendirajte talog u 10 ml.
Pripremite 10 sterilnih mikroepruveta od 1,5 ml s 900 µl resuspendiranog taloga.
U prvu mikroepruvetu dodajte 100 µl suspenzije C. m. subsp. sepedonicus. Promiješajte na vrtložnoj miješalici.
U sljedećih pet mikroepruveta pripremite decimalna razrjeđenja.
Ovih šest mikroepruveta s kontaminiranim ekstraktom koristite za pozitivnu kontrolu. Četiri mikroepruvete s nekontaminiranim ekstraktom koristite za negativnu kontrolu. U skladu s tim, označite mikroepruvete.
Pripremite alikvote od 100 µl u mikroepruvetama od 1,5 ml tako da dobijete devet kopija svakog kontrolnog uzorka. Do uporabe ih pohranite na – 16 do – 24 °C.
Prisutnost i količinu C. m. subsp. sepedonicus u kontrolnim uzorcima potvrdite najprije IF testom.
Za PCR test, obavite ekstrakciju DNK na pozitivnim i negativnim kontrolnim uzorcima za svaku seriju uzoraka za testiranje.
Za IF i FISH testove, obavite testove na pozitivnim i negativnim kontrolnim uzorcima za svaku seriju uzoraka za testiranje.
Kod IF, FISH i PCR testova, bakterija C. m. subsp. sepedonicus se mora detektirati u najmanje 10⁶ i 10⁴ stanica/ml pozitivnih kontrola i niti u jednoj negativnoj kontroli.

Dodatak 3

Puferi za postupke testiranja
OPĆENITO: Neotvoreni sterilizirani puferi mogu se čuvati do jedne godine.
1. Puferi za postupak ekstrakcije
1.1. Ekstrakcijski pufer (50 mM fosfatni pufer, pH 7,0)
Ovaj se pufer koristi za ekstrakciju bakterije iz biljnih tkiva homogenizacijom ili tresenjem.
Na₂HPO₄ (bezvodni) 4,26 g
KH2PO4 2,72 g
Destilirana voda 1,00 L
Otopite sastojke, provjerite pH i sterilizirajte u autoklavu na 121 °C 15 minuta.
Mogu biti korisni i sljedeći dodatni sastojci:
 

1.2. Pufer za talog (10 mM fosfatni pufer, pH 7,2)
Ovaj se pufer koristi za resuspendiranje i razrjeđivanje ekstrakta jezgre pupaka gomolja krumpira, nakon koncentriranja u talog centrifugiranjem.
Na₂HPO₄.12H₂O 2,7 g
NaH₂PO₄.2H₂O 0,4 g
Destilirana voda 1,00 L
Otopite sastojke, provjerite pH i sterilizirajte u autoklavu na 121 °C 15 minuta.
2. Puferi za IF test
2.1. IF pufer (10 mM fosfatni pufer s dodatkom soli (PBS), pH 7,2)
Ovaj se pufer koristi za razrjeđivanje antitijela.
Na₂HPO₄.12H₂O 2,7 g
NaH₂PO₄.2H₂O 0,4 g
NaCl 8,0 g
Destilirana voda 1.0 L
Otopite sastojke, provjerite pH i sterilizirajte u autoklavu na 121 °C 15 minuta.
2.2. IF pufer – Tween
Ovaj se pufer koristi za ispiranje stakalca.
IF puferu dodajte 0,1 % Tween 20.
2.3. Glicerol s fosfatnim puferom, pH 7,6
Ovaj se pufer koristi kao tekućina za prekrivanje jažica u IF testu kako bi se pojačala fluorescencija.
Na₂HPO₄.12H₂O 3,2 g
NaH₂PO₄.2H₂O 0,15 g
Glicerol 50 ml
Destilirana voda 100 ml
Pokrivne otopine protiv izblijeđivanja dostupne su na tržištu, npr. Vectashield® (Vector Laboratories) ili Citifluor® (Leica).
Dodatak 4
Određivanje stupnja kontaminacije u IF i FISH testovima
1. Odredite srednji broj tipičnih fluorescentnih stanica po vidnom polju (c)
2. Izračunajte broj tipičnih fluorescentnih stanica po jažici mikroskopskog stakalca (C)
C = c × S/s
gdje je
S = površina jažice stakalca sa više jažica, i
s = površina polja objektiva.
s = πi2/4G2K2
gdje je
i = koeficijent polja (varira od 8 do 24 ovisno o tipu okulara)
K = koeficijent tubusa (1 ili 1,25)
G = povećanje objektiva (100x, 40x itd.).
3. Izračunajte broj tipičnih fluorescentnih stanica po ml resuspendiranog taloga (N)
N = C × 1000/y × F
gdje je
y = volumen resuspendiranog taloga na svakom oknu, i
F = faktor razrjeđenja resuspendiranog taloga.
Dodatak 5
Hranjive podloge za izolaciju i uzgoj C. m. subsp. sepedonicus
(a) Opće hranjive podloge
Hranjivi agar (NA)
Hranjivi agar (Difco) 23,0 g
Destilirana voda 1,0 L
Otopite sastojke i sterilizirajte u autoklavu na 121 °C 15 minuta.
Hranjivi agar s dekstrozom (NDA)
Difco bacto hranjivi agar koji sadrži 1 % D(+) glukoze (monohidrata). Sterilizirajte u autoklavu na 115 °C 20 minuta.
Agar s kvascem, peptonom i glukozom (YPGA)
Ekstrakt kvasca (Difco) 5,0 g
Bacto pepton (Difco) 5,0 g
D(+) glukoza (monohidrat) 10,0 g
Agar Bacto (Difco) 15,0 g
Destilirana voda 1,0 L
Otopite sastojke i sterilizirajte u autoklavu na 121 °C 15 minuta.
Agar s ekstraktom kvasca i mineralnim solima (YGM)
Bacto ekstrakt kvasca (Difco) 2,0 g
D(+) glukoza (monohidrat) 2,5 g
K₂HPO₄ 0,25 g
KH₂HPO₄ 0,25 g
MgSO₄.7H₂O 0,1 g
MnSO₄.H₂O 0,015 g
NaCl 0,05 g
FeSO₄.7H₂O 0,005 g
Bacto agar (Difco) 18 g
Destilirana voda 1,0 L
Otopite sastojke i sterilizirajte 0,5 litara volumena hranjive podloge u autoklavu na 121 °C 15 minuta.
(b) Validirane selektivne hranjive podloge
MTNA
Osim ako nije drugačije navedeno, svi sastojci su iz BDH.
Ekstrakt kvasca (Difco) 2,0 g
Manitol 2,5 g
K₂HPO₄ 0,25 g
KH₂PO4 0,25 g
NaCl 0,05 g
MgSO₄.7H₂O 0,1 g
MnSO₄.H₂O 0,015 g
FeSO₄.7H₂O 0,005 g
Agar (Oxoid br. 1) 16,0 g
Destilirana voda 1,0 L
Otopite sastojke, podesite pH na 7,2. Nakon sterilizacije u autoklavu (na 121 °C 15 minuta) i hlađenja na 50 °C, dodajte antibiotike: trimetoprim 0,06 g, nalidiksičnu kiselinu 0,002 g, amfotericin B 0,01 g.
Osnovne otopine antibiotika: trimetoprim (Sigma) i nalidiksična kiselina (Sigma) (oboje na 5 mg/ml), u 96 %-tnom metanolu, amfotericin B (Sigma) (1 mg/ml) u dimetilsulfoksidu. Osnovne otopine su sterilizirane filtriranjem.
Napomena:
Rok trajanja osnovne hranjive podloge je tri mjeseca. Nakon što se dodaju antibiotici, rok trajanja je jedan mjesec kada se čuva u hladnjaku.
NCP-88
Hranjivi agar (Difco) 23 g
Ekstrakt kvasca (Difco) 2 g
D-manitol 5 g
K₂HPO₄ 2 g
KH₂PO₄ 0,5 g
MgSO₄.7H₂O 0,25 g
Destilirana voda 1,0 L
Otopite sastojke, podesite pH na 7,2. Nakon sterilizacije u autoklavu (na 121 °C 15 minuta) i hlađenja na 50 °C, dodajte sljedeće antibiotike: Polimiksin B sulfat (Sigma) 0,003 g, nalidiksičnu kiselinu (Sigma) 0,008 g, Cikloheksimid (Sigma) 0,2 g.
Pripremite osnovne otopine antibiotika: nalidiksična kiselina u 0,01 M NaOH, cikloheksimid u 50 % etanolu, polimiksin B sulfat u destiliranoj vodi. Osnovne otopine su sterilizirane filtriranjem.
Napomena:
Rok trajanja osnovne hranjive podloge je tri mjeseca. Nakon što se dodaju antibiotici, rok trajanja je jedan mjesec kada se čuva u hladnjaku.
Dodatak 6
Validirani protokoli i reagensi za PCR
Napomena:
Preliminarna testiranja trebaju omogućiti ponovljivu detekciju 10³ do 10⁴ stanica bakterije C. m. subsp. sepedonicus po ml ekstrakta uzorka.
Preliminarna testiranja ne smiju dati lažno pozitivne rezultate kod određenih odabranih bakterijskih sojeva.
1. Protokol za multipleks PCR s unutarnjom PCR kontrolom (Pastrik, 2000)
1.1. Oligonukleotidne početnice
Uzvodna početnica PSA-1 5´- ctc ctt gtg ggg tgg gaa aa -3´
Nizvodna početnica PSA-R 5´- tac tga gat gtt tca ctt ccc c -3´
Uzvodna početnica NS-7-F 5´- gag gca ata aca ggt ctg tga tgc -3´
Nizvodna početnica NS-8-R 5’- tcc gca ggt tca cct acg ga -3’
Očekivana dužina umnoženog produkta iz kalupa DNK C. m. subsp. sepedonicus = 502 pb (par početnica PSA).
Očekivana dužina umnoženog produkta iz 18S rRNA unutarnje kontrole = 377 pb (par početnica NS).
1.2. Reakcijska smjesa za PCR
 

1Metoda je bila validirana Taq polimerazom iz Perkin Elmer (AmpliTaq ili Gold) i Gibco BRL.
2Koncentracija početnica NS-7 F i NS-8-R je bila optimizirana za ekstrakciju jezgre pupka krumpira metodom homogenizacije i pročišćavanja DNK prema Pastriku (2000) (vidi dio 6.1.a i 6.2). Ponovna optimizacija koncentracija reagensa bit će potrebna ako se upotrijebi ekstrakcija tresenjem ili druga metoda izolacije DNK.
1.3. Uvjeti PCR reakcije
Izvedite sljedeći program:
1 ciklus: (i) 3 minute na 95 °C (denaturacija kalupa DNK)
10 ciklusa: (ii) 1 minutu na 95 °C (denaturacija kalupa DNK)
(iii) 1 minuta na 64 °C (sparivanje početnica i kalupa)
(iv) 1 minuta na 72 °C (produljivanje kopije)
25 ciklusa: (v) 30 sekundi na 95 °C (denaturacija kalupa DNK)
(vi) 30 sekundi na 62 °C (sparivanje početnica i kalupa)
(vii) 1 minuta na 72 °C (produljivanje kopije)
1 ciklus: (viii) 5 minuta na 72 °C (konačno produljivanje)
(ix) držati na 4 °C.
Napomena:
Ovaj je program optimiziran za uporabu sorabu s uređajem za PCR MJ Research0. Kod uporabe s drugim modelima vjerojatno će biti potrebno prilagoditi trajanje ciklusa (ii), (iii) (iv), (v), (vi) i (vii).
1.4. Analiza produkta umnožavanja restrikcijskim enzimom
PCR produkti umnoženi iz DNK bakterije C. m. subsp. sepedonicus daju karakteristični obrazac polimorfizma duljine restrikcijskih fragmenata s enzimom Bgl II nakon inkubacije na 37 °C 30 minuta. Restrikcijski fragmenti dobiveni iz specifičnoga fragmenta C. m. subsp. sepedonicus su veličine 282 bp i 220 bp.
2. Priprema pufera za nanošenje
2.1. Bromfenol plavilo (10 %-tna osnovna otopina)
Bromfenol plavilo 5 g
Destilirana voda (bidestilirana) 50 ml
2.2. pufer za nanošenje
Glicerol (86 %) 3,5 ml
Bromfenol plavilo (5.1) 300 µl
Destilirana voda (bidestilirana) 6,2 ml
3. 10x Tris acetatni EDTA pufer (TAE), pH 8,0
Tris pufer 48,4 g
Ledena octena kiselina 11,42 ml
EDTA (dinatrijeva sol) 3,72 g
Destilirana voda 1,00 L
Razrijedite do 1× prije uporabe.
Dostupan je i na tržištu (npr. Invitrogen ili jednakovrijedan).
Dodatak 7
Validirani reagensi za FISH test
1. Oligo-probe
Specifična proba za Cms CMS-CY3-01: 5´- ttg cgg ggc gca cat ctc tgc acg -3´
Nespecifična eubakterijska proba EUB-338-FITC: 5´- gct gcc tcc cgt agg agt -3´
2. Otopina za fiksiranje
(UPOZORENJE! OTOPINA ZA FIKSIRANJE SADRŽI PARAFORMALDEHID KOJI JE TOKSIČAN. NOSITE RUKAVICE I NE UDIŠITE GA. PREPORUČUJE SE RADITI U DIGESTORU.)
(i) Zagrijte 9 ml vode za molekularnu biologiju (npr. ultra čiste vode) na oko 60 °C i dodajte 0,4 g paraformaldehida. Paraformaldehid se otapa nakon što dodate 5 kapi 1N NaOH i promiješate na magnetskoj miješalici.
(ii) Podesite pH na 7,0 dodajući 1 ml 0,1M fosfatnog pufera (PB; pH 7,0) i 5 kapi 1N HCl. Indikatorskim papirom provjerite vrijednost pH i ako je potrebno podesite je pomoću HCl ili NaOH.
(UPOZORENJE! U OTOPINAMA S PARAFORMALDEHIDOM NE UPOTREBLJAVAJTE pH METAR)
(iii) Profiltrirajte otopinu kroz membranski filter od 0,22 µm te je do daljnje uporabe pohranite na 4 °C i zaštitite od prašine.
(iv) Napomena:
Alternativna otopina za fiksiranje: 96 %-tni etanol.
3. 3x Hybmix
NaCl 2,7 M
Tris-HCl 60 mM (pH 7,4)
EDTA (sterilizirana filtriranjem i u autoklavu) 15 mM
Razrijedite do 1x prema potrebi.
4. Otopina za hibridizaciju
1x Hybmix
Natrijev dodecil sulfat (SDS) 0,01 %
Proba EUB 338 5 ng/μl
Proba CMSCY301 5 ng/μl
Pripremite količine otopine za hibridizaciju prema izračunima u Tablici 1. Za svako stakalce (s 2 različita uzorka u duplikatu) treba 90 μl otopine za hibridizaciju.
Tablica: Predložene količine za pripremanje smjese za hibridizaciju
 

Napomena:
Pohranite sve otopine koje sadrže oligo-probe osjetljive na svjetlost u mraku na –20 °C. Zaštitite od direktne sunčeve svjetlosti ili električne rasvjete tijekom uporabe.
5. 0,1M fosfatni pufer, pH 7,0
Na₂HPO₄ 8,52 g
KH₂PO₄ 5,44 g
Destilirana voda 1,00 L
Otopite sastojke, provjerite pH i sterilizirajte u autoklavu na 121 °C 15 minuta.
Dodatak 8
Uzgoj patlidžana
Posijte sjeme patlidžana (Solanum melongena) u pasteriziranom kompostu za sjeme. Presadite sadnice s potpuno razvijenim supkama (10 do 14 dana) u pasteriziran kompost za lončanice.
Patlidžani se trebaju uzgajati u stakleniku pod sljedećim uvjetima:
Dužina dana: 14 sati ili prirodna dužina dana, ako je dulja;
Temperatura: dan: 21 do 24 °C,
noć: 15 °C.
Osjetljive sorte patlidžana: »Black Beauty«,
»Long Tom«,
»Rima«,
»Balsas«
Dobavljač: vidi mrežnu stranicu http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main
Dodatak 9
Postupak bojenja po Gramu (Huckerova modifikacija) (Doetsch, 1981.)
Otopina kristal violeta
Otopite 2 g kristal violeta u 20 ml 95 %-tnog etanola.
Otopite 0,8 g amonij-oksalata u 80 ml destilirane vode.
Pomiješajte dvije otopine.
Lugolova otopina
Jod 1 g
Kalij-jodid 2 g
Destilirana voda 300 ml
Usitnite zajedno koristeći tučak i mužar. Dodajte vodi i promućkajte da se otopi u zatvorenoj posudi.
Otopina safranina za protubojenje
Osnovna otopina:
Safranin O 2,5 g
95 %-tni etanol 100 ml
Promiješajte i pohranite.
Razrijedite: 1:10 da bi dobili radnu otopinu.
Postupak bojenja
1. Pripremite razmaze, posušite na zraku i fiksirajte zagrijavanjem.
2. Prelijte stakalce otopinom kristal violeta jednu minutu.
3. Kratko isperite tekućom vodom.
4. Prelijte Lugolovom otopinom jednu minutu.
5. Isperite tekućom vodom i posušite filtar-papirom.
6. Uklonite boju 95 %-tnim etanolom, koji se dodaje kap po kap, dok se sva boja ne ukloni ili uronite razmaz na 30 sekundi i lagano tresite.
7. Isperite tekućom vodom i posušite filtar-papirom.
8. Prelijte otopinom safranina 10 sekundi.
9. Isperite tekućom vodom i posušite filtar-papirom.
Gram pozitivne bakterije se oboje ljubičasto-plavo; Gram negativne bakterije se oboje ružičasto-crveno.
LITERATURA
1. Anonymous, 1987. Scheme of the detection and diagnosis of the ring rot bacterium Corynebacterium sepedonicum in batches of potato tubers. Commission of the European Communities, Luxembourg. Publ EUR 11288 EN, 21 str.
2. Bradbury, J. F., 1970. Isolation and preliminary study of bacteria from plants. Rev. Pl. Path., 49, 213-218.
3. Dinesen, I. G., 1984. The extraction and diagnosis of Corynebacterium sepedonicum from diseased potato tubers. EPPO Bull. 14 (2), 147-152.
4. Doetsch, R. N., 1981. Determinative methods of light microscopy. In: Manual of methods for general bacteriology, American Society for Microbiology, Washington, 21-23.
5. Hugh, R. and Leifson, F., 1953. The taxonomic significance of fermentative versus oxidative metabolism of carbohydrates by various gram-negative bacteria. J. Bact., 66, 24-26.
6. Janse, J. D., 1991. Infra- and intra-specific classification of Pseudomonas solanacearum strains using whole cell fatty-acid analysis. Systematic and Applied Microbiology 14; 335-345.
7. Janse, J. D. and J. Van Vaerenbergh. The interpretation of the EC method for the detection of latent ring rot infections (Corynebacterium sepedonicum) in potato. EPPO Bull., No 17, 1987, str. 1-10.
8. Jansing, H. and K. Rudolph, 1998. Physiological capabilities of Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus and development of a semi-selective medium. Journal of Plant Diseases and Protection, 105, 590-601.
9. Kovacs, N., 1956. Identification of Pseudomonas pyocyanea by the oxidase reaction. Nature, Lond., 178, 703.
10. Klement Z.; Rudolph, K and D. C. Sands, 1990. Methods in Phytobacteriology. Akadémiai Kiadó, Budapest, 568 str.
11. Lelliott, R. A., 1966. The plant pathogenic coryneform bactem bacteria. J. appl. Bact., 29, 1
12. Lelliott, R. A., E. Billing and A. C. Hayward, 1966. A determinative scheme for the fluorescent plant pathogenic pseudomonads J. appl. Bact., 29, 470-489.
13. Lelliott, R. A. and P. W., Sellar, 1976. The detection of latent ring rot (Corynebacterium sepedonicum (Spiek. et Kotth.) Skapt. et Burkh.) in potato stocks. EPPO Bull., 6 (2), 101-106.
14. Li, X. and S.H. de Boer, 1995. Selection of Polymerase Chain Reaction primers from RNA intergenic spacer region for specific detection of Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus. Phytopathology, 85, 837-842.
15. Mills, D., Russell, B., W. and J., W. Hanus, 1997. Specific detection of Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus by amplification of three unique DNA sequences isolated by subtraction hybridization. Phytopathology, 87, 8, 853-861.
16. Pastrik, K.-H. and R.A. Rainey. 1999. Identification and differentiation of Clavibacter michiganensis subspecies by polymerase chain reaction-based techniques. J. Phytopathology 147; 687-693.
17. Pastrik, K.-H., 2000. Detection of Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus in potato tubers by multiplex PCR with coamplification of host DNA. European Journal of Plant Pathology, 106, 155-165.
18. Ramamurthi, C. S., 1959. Comparative studies on some Gram-positive phytopathogenic bacteria and their relationship to the Corynebacteria. Mem. Cornell agric. Exp. Sta., 366, 52 str.
19. Schaad, W., Berthier-Schaad, Y., Sechler, A. and Knorr, D. (1999) Detection of Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus in potato tubers by BIO-PCR and an automated real-time fluorescence detection system. Plant Disease 83; 1095–1100.
20. Schaad, W. 2001. Laboratory guide for identification of plant pathogenic bacteria. Schaad [Hrsg.]. — 3. ed.; St. Paul, Minnesota:, 373 str.
21. Skerman, V. B. D., 1967. A guide to the identification of the genera of bacteria. 2nd ed., William and Wilkins Company, Baltimore.
22. Smith, N. C.; Hennesy, J; Stead, D.E., 2001. Repetetive sequence-derived PCR profiling using the BOX-A1 Ralstonia solanacearum primer for rapid identification of plant pathogen Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus. European Journal of Plant Pathology, 107 (7), 739-748.
23. Sneath, P. H. A. and V. G. Collins, 1974. A study in test reproductibility between laboratories: report of Pseudomonas working party. Antonie van Leeuwenhoek, 40, 481-527.
24. Stead, D.E. 1992. Grouping of plant pathogenic and some other Pseudomonas spp. using cellular fatty-acid profiles. International Journal of Systematic Bacteriology 42; 281-295.
25. Wullings, B. A.; van Beuningen, A. R.; Janse, J. D. and A. D. L. Akkermans, 1998. Detection of Ralstonia solanacearum, which causes brown rot of potato, by fluorescent in situ hybridization with 23s rRNA-targeted probes. Appl. Environ. Microbiol. 64, 4546–4554.